Forskellen Mellem NGS Og Sanger-sekventering

2024 Forfatter: Mildred Bawerman | [email protected]. Sidst ændret: 2023-12-16 08:37

Nøgleforskel - NGS vs Sanger-sekventering

Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotidsekventeringsteknikker, der er udviklet over tid. Sanger-sekventeringsmetoden blev bredt brugt i mange år, og NGS udskiftede den for nylig på grund af dens fordele. Nøgleforskellen mellem NGS og Sanger-sekventering er, at NGS arbejder på princippet om sekventering af millioner af sekvenser samtidigt på en hurtig måde gennem et sekventeringssystem, mens Sanger-sekventering fungerer på princippet om kædetermination på grund af selektiv inkorporering af dideoxynukleotider af DNA-polymeraseenzym under DNA-replikation og resulterende fragmentseparation ved kapillær elektroforese.

INDHOLD

1. Oversigt og nøgleforskel

2. Hvad er nukleotidsekventering

3. Hvad er NGS

4. Hvad er Sanger-sekventering

5. Sammenligning side om side - NGS vs Sanger-sekventering

6. Resumé

Hvad er nukleotidsekventering?

Genetisk information lagres i nukleotidsekvenserne af en organisms DNA eller RNA. Processen til bestemmelse af den korrekte rækkefølge af nukleotider (ved anvendelse af fire baser) i et givet fragment (i et gen, en klynge af gener, kromosom og komplet genom) er kendt som nukleotidsekventering. Det er meget vigtigt i genomiske studier, retsmedicinske studier, virologi, biologisk systematisk, medicinsk diagnose, bioteknologi og på mange andre områder at analysere strukturen og funktionen af gener. Der er forskellige typer af sekventeringsmetoder udviklet af forskere. Blandt dem blev Sanger-sekventering udviklet af Frederick Sanger i 1977 meget brugt og populariseret i lang tid, indtil Next Generation Sequencing erstattede det.

Hvad er NGS?

Next Generation Sequencing (NGS) er et udtryk, der bruges til at henvise til moderne sekvenseringsprocesser med høj kapacitet. Den beskriver en række forskellige moderne sekventeringsteknologier, der revolutionerede genomiske studier og molekylærbiologi. Disse teknikker er Illumina-sekventering, Roche 454-sekventering, Ion Proton-sekventering og SOLiD (sekventering ved Oligo Ligation Detection) -sekventering. NGS-systemer er hurtigere og billigere. Fire primære DNA-sekventeringsmetoder anvendes i NGS-systemer, nemlig; pyrosekventering, sekventering ved syntese, sekventering ved ligering og ionhalvledersekventering. Et stort antal DNA- eller RNA-tråde (millioner af) kan sekventeres parallelt. Det muliggør sekventering af hele genomet af organismer inden for en kort tidsperiode, i modsætning til Sanger-sekventering, som tager mere tid.

NGS har mange fordele i forhold til konventionel Sanger-metode til sekventering. Det er en hurtigere, mere nøjagtig og omkostningseffektiv proces, der kan udføres med en lille stikprøvestørrelse. NGS kan bruges i metagenomiske undersøgelser, til påvisning af variationer inden for et individuelt genom på grund af insertioner og deletioner osv. Og i analysen af genekspressioner.

Figur_1: Udvikling i NGS-sekventering

Hvad er Sanger Sequencing?

Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for at bestemme den nøjagtige nukleotidrækkefølge for et givet DNA-fragment. Det er også kendt som kædetermineringssekventering eller Dideoxy-sekventering. Arbejdsprincippet ved denne metode er afslutningen af strengsyntese ved selektiv inkorporering af en kæde, der afslutter dideoxynukleotider (ddNTP'er) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP af DNA-polymerase under replikationen af DNA. Normale nukleotider har 3'OH-grupper til dannelse af en phosphodiesterbinding mellem tilstødende nukleotider for at fortsætte strengdannelsen. Imidlertid mangler ddNTP'er denne 3 'OH-gruppe og er ude af stand til at danne phosphodiesterbindinger mellem nukleotider. Derfor er kædeforlængelsen ophørt.

I denne metode tjener det enkeltstrengede DNA, der skal sekventeres, som skabelonstreng til in vitro DNA-syntese. Andre krav er oligonukleotidprimer, deoxynukleotidforløbere og DNA-polymeraseenzym. Når målgruppens flankerende ender er kendt, kan primere let designes til DNA-replikation. Fire separate DNA-syntesereaktioner udføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTP'er sammen med andre krav. Fra det særlige nukleotid tilsættes en blanding af dNTP'er og ddNTP'er. Ligeledes udføres fire separate reaktioner i fire rør med fire blandinger. Efter reaktionerne udføres påvisning af DNA-fragmenter og omdannelse af fragmentmønsteret til sekvensinformation. Resulterende DNA-fragmenter varmedenatureres og adskilles ved gelelektroforese. Hvis der anvendes radioaktive nukleotider, kan båndmønsteret i polyacrylamidgel visualiseres ved autoradiografi. Når denne metode bruger de fluorescerende mærkede dideoxynukleotider, kan den mindskes ned ad gelen læses og føres gennem en laserstråle, der detekteres af den fluorescerende detektor. For at undgå fejl, der kan opstå, når en sekvens læses af øjet og manuelt indtaster en computer, udviklede denne metode sig til brug af automatiseret sequencer kombineret med computeren. For at undgå fejl, der kan opstå, når en sekvens læses af øjet og indtastes manuelt i en computer, udviklede denne metode sig til brug af automatiseret sequencer kombineret med computeren. For at undgå fejl, der kan opstå, når en sekvens læses af øjet og manuelt indtaster en computer, udviklede denne metode sig til brug af automatiseret sequencer kombineret med computeren.

Dette er metoden, der bruges til at sekvensere DNA fra Human Genome-projektet. Denne metode er stadig i brug med avancerede ændringer, fordi den giver nøjagtig sekvensinformation på trods af at det er en dyr og langsom proces.

Figur_2: Sanger-sekventering

Hvad er forskellen mellem NGS og Sanger Sequencing?

Diff artikel midt foran bordet

NGS vs Sanger-sekventering
Next Generation Sequencing (NGS) henviser til moderne sekvenseringsprocesser med høj kapacitet. Den beskriver en række forskellige moderne sekventeringsteknologier	Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger til at bestemme den nøjagtige nukleotidrækkefølge for et givet DNA-fragment.
Omkostningseffektivitet
NGS er en billigere proces, fordi den reducerer tid, menneskekraft og kemikalier.	Dette er en kostbar proces, fordi det tager tid, menneskekraft og flere kemikalier.
Hastighed
Dette er hurtigere, da både kemisk detektion og signaldetektering af mange tråde sker parallelt.	Dette er tidskrævende, da kemisk detektion og signaldetektering sker som to separate processer og kun på streng kan læses ad gangen.
Pålidelighed
NGS er pålidelig.	Sanger-sekventering er mindre pålidelig
Prøvestørrelse
NGS kræver mindre mængde DNA.	Denne metode har brug for en stor mængde skabelon-DNA.
DNA-baser pr. Sekventeret fragment
Antallet af DNA-baser pr. Sekventeret fragment er lavere end Sanger-metoden	Genererende sekvenser er længere end NGS-sekvenser.

Resumé - NGS vs Sanger Sequencing

NGS og Sanger-sekventering er nukleotidsekventeringsteknikker, der i vid udstrækning anvendes i molekylærbiologi. Sanger-sekventering er en tidlig sekventeringsmetode, der blev erstattet af NGS. Den største forskel mellem NGS og Sanger-sekventering er, at NGS er en hurtig, mere nøjagtig og omkostningseffektiv proces end Sanger-sekventering. Begge teknikker skabte store udbrud inden for genetik og bioteknologi.