Nøgleforskel - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotider er de grundlæggende strukturelle enheder og byggesten i DNA. DNA-molekyle er sammensat af en polynukleotidkæde. Der findes fire forskellige nukleotider i DNA. Disse nukleotider er sammensat af fire forskellige nitrogenholdige baser med navnet A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (thymin). Rækkefølgen af nukleotiderne i DNA-molekylet har stor betydning, da den koder for vigtig genetisk information for vækst og udvikling af organismer. DNA-sekventering henviser til den proces, der bestemmer den nøjagtige nukleotidsekvens af DNA'et. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Maxam Gilbert-sekventering og Sanger DNA-sekventering er to metoder til DNA-sekventering, der hører til første generations sekventering. Maxam Gilbert-sekventeringsprocedure bestemmer basesekvensen ved kemisk spaltning af 5'-endemærkede DNA-fragmenter fortrinsvis ved hver af fire nukleotider og gelelektroforese. Sanger-sekventeringsprocedure bestemmer nukleotidsekvensen ved syntetisering af enkeltstrenget DNA ved anvendelse af DNA-polymerase og dideoxynukleotider og gelelektroforese. Dette er nøgleforskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er Maxam Gilbert
3. Hvad er Sanger-sekventering
4. Side om side-sammenligning - Maxam Gilbert vs Sanger-sekventering
5. Resume
Hvad er Maxam Gilbert sekventering?
Maxam Gilbert-sekventering, også kendt som kemisk sekventeringsmetode, er en teknik, der blev udviklet til at bestemme rækkefølgen af nukleotiderne i DNA. Denne metode blev introduceret af Walter Gilbert og Alan Maxam i 1976 og blev populær, da den kan udføres direkte med oprenset DNA. Maxam Gilbert-metoden tilhører den første generation af DNA-sekventering, og det var den første sekventeringsmetode, der blev brugt bredt af forskere.
Grundprincippet for denne metode ligger i begrænsningen af de endemærkede DNA-fragmenter ved specifikke baser ved hjælp af basespecifikke kemikalier og betingelser og adskillelse af de mærkede fragmenter ved elektroforese som vist i figur 01. Fragmenter adskilles i henhold til deres størrelse på gel. Da fragmenterne er mærket, kan sekvensen af DNA-molekylet let udledes.
Maxam gilbert-metoden bruger basisspecifikke kemikalier til at bryde DNA på specifikke baser. To almindelige kemikalier med navnet dimethylsulfat og hydrazin-kemikalier bruges til selektivt at angribe henholdsvis puriner og pyrimidiner.
Maxam Gilbert sekventeringsmetode udføres via flere trin som følger.
- Oprensning af DNA-sekvensen under anvendelse af restriktionsendonukleaser
- Mærkning af enderne af DNA-fragmenterne ved tilsætning af radioaktive fosfater
- Oprensning af de mærkede fragmenter fra ikke-mærkede fragmenter ved gelelektroforese
- Separation af det endemærkede DNA i fire rør og behandling med basespecifikke kemikalier separat
- Elektroforese af indholdet af hvert rør på separate linjer på en gel- og fragmentseparation i henhold til deres længde.
- Påvisning af fragmenterne ved hjælp af autoradiograf.
Figur 01: Maxam Gilbert sekventering
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for at bestemme basesekvensen for et givet DNA-fragment. Det er også kendt som kædetermineringssekventering eller Dideoxy-sekventeringsmetode. Denne metode fungerer på princippet om selektiv inkorporering af kædeterminerende dideoxynukleotider (ddNTP'er) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP af DNA-polymerase under syntesen af enkeltstrenget DNA for at afslutte dannelse af streng. Dideoxynukleotider mangler 3'OH-grupper til dannelse af phosphodiesterbindinger med tilstødende nukleotid. Derfor stoppes strengdannelsen, når en ddNTP er inkorporeret i den nydannende streng under sanger-sekventering.
I denne metode udføres fire separate DNA-syntesereaktioner (PCR) i fire separate rør med en type ddNTP. Andre krav leveres også til rør til PCR inklusive primere, dNTP'er, Taq-polymerase, specifikke betingelser osv. Fire separate reaktioner udføres i fire rør med fire blandinger. Efter PCR-reaktioner varmeresatureres resulterende DNA-fragmenter og adskilles ved gelelektroforese. Derefter visualiseres fragmenterne ved hjælp af enten en mærket (radioaktiv eller fluorescerende) primer eller dNTP'er som vist i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekventering
Hvad er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing?
Diff artikel midt foran bordet
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sekventering er den første teknik, der er udviklet til DNA-sekventering. | Sanger-sekventeringsmetode blev introduceret efter Maxam Gilbert-sekventeringsmetoden. |
| Anvendelse | |
| Denne metode bruges sjældent. | Sanger-sekventering bruges rutinemæssigt til sekventering. |
| Brug af farlige kemikalier | |
| Det bruger farlige kemikalier. | Brug af farlige kemikalier er begrænset sammenlignet med Maxam Gilbert-metoden. |
| Mærkning til påvisning | |
| Denne metode bruger radioaktivt P 32 til mærkning af enderne af DNA-fragmenterne. | Sanger-sekventering bruger radioaktivt eller fluorescerende mærkede ddNTP'er. |
Resumé - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert og Sanger-sekventering er to typer DNA-sekventeringsteknikker, der kommer under første generation af DNA-sekventering. Maxam Gilbert-sekventering er den første metode, der blev introduceret til DNA-sekventering i 1976, og den udføres ved at bryde de endemærkede DNA-fragmenter af basespecifikke kemikalier. Derfor er det kendt som kemisk sekventering. Sanger-sekventeringsmetode blev introduceret i 1977 og er baseret på de ddNTP-drevne kædeafslutningsreaktioner. Sanger-sekventeringsmetode populær end Maxam Gilbert-metoden på grund af adskillige ulemper ved Maxam Gilbert-metoden såsom overdreven tidsforbrug, brug af farlige kemikalier osv. Dette er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger-sekventering.
