Nøgleforskel - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekventering er meget vigtig for DNA-analyse, da viden om det korrekte nukleotidarrangement på en bestemt DNA-region afslører mange vigtige oplysninger om det. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Sanger-sekventering og pyrosekventering er to forskellige DNA-sekventeringsmetoder, der er meget anvendte i molekylærbiologi. Hovedforskellen mellem Sanger-sekventering og pyrosekventering er, at Sanger-sekventering bruger dideoxynukleotider til at afslutte syntesen af DNA til at læse nukleotidsekvensen, mens pyrosekventering detekterer pyrofosfatfrigivelsen ved at inkorporere nukleotiderne og syntetisere den komplementære sekvens for at læse den nøjagtige rækkefølge af sekvensen.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er Sanger-sekventering
3. Hvad er pyrosekventering
4. Sammenligning side om side - Sanger-sekventering vs Pyrosekventering
5. Resumé
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger-sekventering er en første generation af DNA-sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans colleges i 1977. Den er også kendt som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekventering, da den er baseret på kædeafslutning af dideoxynukleotider (ddNTP'er). Denne metode blev bredt brugt i mere end 30 år, indtil den nye generation sekventering (NGS) blev udviklet. Sanger-sekventeringsteknik muliggjorde opdagelsen af den korrekte nukleotidrækkefølge eller vedhæftning af et bestemt DNA-fragment. Det er baseret på selektiv inkorporering af ddNTP'er og afslutning af DNA-syntese under in vitro DNA-replikation. Fraværet af 3'OH-grupper til fortsat dannelse af phosphodiesterbinding mellem tilstødende nukleotider er et unikt træk ved ddNTP'er. Derfor, når ddNTP er knyttet, ophører kædeforlængelsen og slutter fra dette punkt. Der er fire ddNTP'er - ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP - brugt i Sanger-sekventering. Disse nukleotider stopper DNA-replikationsprocessen, når de inkorporeres i den voksende DNA-streng og resulterer i varierende længder af kort DNA. Kapillærgelelektroforese bruges til at organisere disse korte DNA-tråde efter deres størrelse på en gel som vist i figur 01.
Figur 1: kapillærgelelektroforese af syntetiseret kort DNA
Til in vitro-replikation af DNA skal der stilles få krav. De er DNA-polymeraseenzym, skabelon-DNA, oligonukleotidprimere og deoxynukleotider (dNTP'er). I Sanger-sekventering udføres DNA-replikation i fire separate reagensglas sammen med fire typer ddNTP'er separat. Deoxynukleotider erstattes ikke fuldstændigt af de respektive ddNTP'er. En blanding af det bestemte dNTP (for eksempel; dATP + ddATP) er inkluderet i røret og replikeret. Fire separate rørprodukter køres på en gel i fire separate brønde. Derefter kan sekvensen konstrueres som vist i figur 02 ved at læse gelen.
Figur 02: Sanger-sekventering
Sanger-sekventering er en vigtig teknik, der hjælper i mange områder af molekylærbiologi. Human genom-projekt blev gennemført med succes ved hjælp af Sanger-sekventeringsbaserede metoder. Sanger-sekventering er også nyttig i mål-DNA-sekventering, kræft- og genetisk sygdomsforskning, genekspressionsanalyse, human identifikation, patogenpåvisning, mikrobiel sekventering osv.
Der er flere ulemper ved Sanger-sekventering:
- Længden af det DNA, der sekventeres, kan ikke være længere end 1000 basepar
- Kun en streng kan sekventeres ad gangen.
- Processen er tidskrævende og dyr.
Derfor blev der udviklet nye avancerede sekventeringsteknikker med tiden for at overvinde disse problemer. Sanger-sekventering er dog stadig i brug på grund af dens meget nøjagtige resultater op til ca. 850 baseparlængdefragmenter.
Hvad er Pyrosequencing?
Pyrosekventering er en hidtil ukendt DNA-sekventeringsteknik baseret på "sekventering ved syntese". Denne teknik er afhængig af påvisning af pyrophosphatfrigivelse ved nukleotidinkorporeringen. Processen anvendes af fire forskellige enzymer: DNA-polymerse, ATP-sulfurylase, luciferase og apyrase og to substrater adenosin-5'-phosphosulfat (APS) og luciferin.
Processen starter med primerbinding med den enkeltstrengede DNA-skabelon, og DNA-polymerase starter inkorporeringen af nukleotider, der er komplementære til den. Når nukleotiderne sammenføjes (nukleinsyrepolymerisation) frigiver det pyrophosphat (to fosfatgrupper bundet sammen) grupper og energi. Hver nukleotidtilsætning frigiver ækvimolær mængde pyrophosphat. Pyrophosphat omdannes til ATP med ATP-sulfurylase i nærværelse af substrat APS. Den genererede ATP driver den luciferase-medierede omdannelse af luciferin til oxyluciferin og producerer synligt lys i mængder, der er proportionale med mængden af ATP'er. Lys detekteres af en fotondetekteringsenhed eller af fotomultiplikator og skaber et pyrogram. Apyrase nedbryder ATP og ikke-inkorporerede dNTP'er i reaktionsblandingen. tilføjelse af dNTP udføres en gang ad gangen. Da tilsætningen af nukleotid er kendt ifølge inkorporeringen og påvisningen af lys, kan rækkefølgen af skabelonen bestemmes. Pyrogram bruges til at generere nukleotidsekvensen af prøve-DNA'et som vist i figur 03.
Pyrosekventering er meget vigtig i analyse af enkelt nukleotidpolymorfisme og sekventering af korte DNA-strækninger. Den høje nøjagtighed, fleksibilitet, lette automatisering og parallelle behandling er fordelene ved pyrosekventering i forhold til Sanger-sekventeringsteknikker.
Figur 03: Pyrosekvensering
Hvad er forskellen mellem Sanger Sequencing og Pyrosequencing?
Diff artikel midt foran bordet
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger-sekventering er en DNA-sekventeringsmetode baseret på selektiv inkorporering af ddNTP'er ved DNA-polymerase og kædeterminering. | Pyrosekventering er en DNA-sekventeringsmetode baseret på påvisning af pyrophosphatfrigivelse ved inkorporering af nukleotid. |
| Brug af ddNTP | |
| ddNTP'er bruges til at afslutte DNA-replikationen | ddNTP'er bruges ikke. |
| Involverede enzymer | |
| Der anvendes DNA-polymerase. | Der anvendes fire enzymer: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, Luciferase og Apyrase. |
| Underlag anvendt | |
| APS og Luciferin anvendes ikke. | Adenosin 5 'phosphosulfat (APS) og luciferin anvendes. |
| Maksimal temperatur | |
| Dette er en langsom proces. | Dette er en hurtig proces. |
Resumé - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekventering og pyrosekventering er to DNA-sekventeringsmetoder, der anvendes i molekylærbiologi. Sanger-sekventering konstruerer rækkefølgen af nukleotiderne i sekvens ved at afslutte kædeforlængelsen, mens pyrosekventeringen konstruerer den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i sekvens ved inkorporering af nukleotider og detektering af frigivelsen af pyrophosphater. Derfor er den største forskel mellem Sanger-sekventering og Pyrosekventering, at Sanger-sekventering virker på sekventering ved kædeterminering, mens pyrosekventering fungerer på sekventering ved syntese.
