Nøgleforskel - Microarray vs RNA-sekventering
Transcriptome repræsenterer hele indholdet af RNA til stede i en celle inklusive mRNA, rRNA, tRNA, nedbrudt RNA og ikke-nedbrudt RNA. Profilering af transkriptom er en vigtig proces for at forstå celleindsigten. Der er flere avancerede metoder til transskriptionsprofilering. Microarray og RNA-sekventering er to typer teknologier udviklet til at analysere transkriptom. Hovedforskellen mellem mikroarray og RNA-sekventering er, at microarray er baseret på hybridiseringspotentialet for foruddesignede mærkede prober med mål-cDNA-sekvenser, mens RNA-sekventering er baseret på den direkte sekventering af cDNA-tråde ved avancerede sekventeringsteknikker såsom NGS. Microarray udføres med forudgående viden om sekvenserne, og RNA-sekventering udføres uden forudgående viden om sekvenser.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er mikroarray
3. Hvad er RNA-sekventering
4. Sammenligning side om side - Microarray vs RNA-sekventering
5. Resume
Hvad er Microarray?
Microarray er en robust, pålidelig og høj gennemstrømningsmetode, der anvendes til transkriptomprofilering af forskere. Det er den mest populære tilgang til transkriptionsanalyse. Det er en billig metode, der afhænger af hybridiseringsproberne.
Teknikken starter med ekstraktion af mRNA fra prøven og opførelsen af cDNA-bibliotek fra total RNA. Derefter blandes det med fluorescensmærkede forud designede prober på en fast overflade (spotmatrix). Komplementære sekvenser hybridiserer med de mærkede prober i mikroarrayet. Derefter vaskes mikroarray og screenes, og billedet kvantificeres. Indsamlede data skal analyseres for at få de relative ekspressionsprofiler.
Intensiteten af mikroarrayprober antages at være proportional med mængden af udskrifter i prøven. Imidlertid afhænger nøjagtigheden af teknikken af de designede prober, forudgående kendskab til sekvensen og affiniteten af prober til hybridisering. Derfor har mikroarray-teknologi begrænsninger. Microarray-teknik kan ikke udføres med transkriptioner med lav overflod. Det differentierer ikke isoformer og identificerer genetiske varianter. Da denne metode afhænger af hybridisering af prober, forekommer nogle problemer relateret til hybridisering såsom krydshybridisering, uspecifik hybridisering osv. I mikroarray-teknik.
Figur 01: Microarray
Hvad er RNA-sekventering?
RNA haglgeværsekventering (RNA seq) er en nyudviklet hel transkriptomsekventeringsteknik. Det er en hurtig og høj gennemstrømningsmetode til transcriptome-profilering. Det kvantificerer direkte ekspression af gener og resulterer i dyb undersøgelse af transkriptomet. RNA-sekv. Afhænger ikke af foruddesignede prober eller forudgående kendskab til sekvenserne. Derfor har RNA seq-metoden høj følsomhed og evne til at detektere nye gener og genetiske varianter.
RNA-sekventeringsmetode udføres via flere trin. Samlet RNA i cellen skal isoleres og fragmenteres. Derefter skal der ved hjælp af omvendt transkriptase udarbejdes et cDNA-bibliotek. Hver cDNA-streng skal ligeres med adaptere. Derefter skal de ligerede fragmenter amplificeres og oprenses. Endelig ved anvendelse af en NGS-metode skal sekventering af cDNA'et udføres.
Figur 02: RNA-sekventering
Hvad er forskellen mellem Microarray og RNA-sekventering?
Diff artikel midt foran bordet
Microarray vs RNA-sekventering |
|
| Microarray er en robust, pålidelig metode til høj kapacitet. | RNA-sekventering er en nøjagtig og høj gennemstrømningsmetode. |
| Koste | |
| Dette er en billig metode. | Dette er en dyr metode. |
| Analyse af et stort antal prøver | |
| Dette letter analysering af et stort antal prøver samtidigt. | Dette letter analyseringen af et stort antal prøver. |
| Dataanalyse | |
| Dataanalyse er kompleks. | Flere data genereres i denne metode; derfor er processen mere kompleks. |
| Forudgående viden om sekvenser | |
| Denne metode er baseret på hybridiseringsprober, så forudgående kendskab til sekvenser kræves. | Denne metode afhænger ikke af den tidligere viden om sekvens. |
| Strukturelle variationer og nye gener | |
| Denne metode kan ikke detektere strukturelle variationer og nye gener. | Denne metode kan detektere strukturelle variationer såsom genfusion, alternativ splejsning og nye gener. |
| Følsomhed | |
| Dette kan ikke detektere forskelle i ekspression af isoformer, så dette har begrænset følsomhed. | Dette har høj følsomhed. |
| Resultat | |
| Dette kan kun resultere i relative ekspressionsniveauer. Dette giver ikke absolut kvantificering af genekspression. | Det giver absolutte og relative udtryksniveauer. |
| Data genanalyse | |
| Dette skal genkøres for at analysere igen. | Sekventeringsdata kan genanalyseres. |
| Behov for specifikt personale og infrastruktur | |
| Specifik infrastruktur og personale er ikke påkrævet til mikroarray. | Specifik infrastruktur og personale krævet af RNA-sekventering. |
| Tekniske problemer | |
| Microarray-teknik har tekniske problemer som krydshybridisering, uspecifik hybridisering, begrænset påvisningshastighed for individuelle sonder osv. | RNA seq-teknik undgår tekniske problemer såsom krydshybridisering, uspecifik hybridisering, begrænset påvisningshastighed for individuelle sonder osv. |
| Forstyrrelser | |
| Dette er en forudindtaget metode, da den afhænger af hybridisering. | Bias er lav sammenlignet med mikroarray. |
Resumé - Microarray vs RNA-sekventering
Microarray- og RNA-sekventeringsmetoder er platforme med høj kapacitet udviklet til profilering af transkriptom. Begge metoder giver resultater, der er stærkt korreleret med genekspressionsprofiler. Imidlertid har RNA-sekventering fordele i forhold til mikroarray til genekspressionsanalyse. RNA-sekventering er en mere følsom metode til påvisning af transkriptioner med lav forekomst end mikroarray. RNA-sekventering muliggør også differentiering mellem isoformer og identifikation af genvarianter. Imidlertid er microarray det almindelige valg for de fleste forskere, da RNA-sekventering er en ny og dyr teknik med datalagringsudfordringer og kompleks dataanalyse.
