Hovedforskellen mellem helicase og topoisomerase er, at helicase er et enzym, der adskiller to komplementære tråde af DNA ved at bryde hydrogenbindinger mellem baserne af to tråde, mens topoisomerase er et enzym, der fjerner positive og negative supercoils dannet under afvikling af DNA ved at skære og genforsegling af den ene eller begge tråde af DNA-duplexen.
DNA er en dobbelt helix. Den findes i to komplementære tråde bundet sammen via hydrogenbindinger. DNA-replikering, transkription og DNA-reparation kræver, at to tråde skal adskilles fra hinanden for at fremstille nye kopier, fremstille mRNA og tilføje nukleotider til reparation. De to enzymer helicase og topoisomerase kommer i spil på dette tidspunkt. Derfor er både helicase og topoisomeraser afgørende i DNA-afvikling. Helicase adskiller dobbeltstrenget DNA i enkeltstrenge ved at bryde hydrogenbindingerne mellem nukleotidbaseparene i dobbeltstrenget DNA. I modsætning hertil ophæver topoisomerase DNA-vridningen og aflaster DNA-superspolens natur ved at skære DNA-phosphat-rygraden i en eller begge tråde.
