Nøgleforskel - kloning vs subkloning
Kloning og subkloning er molekylærbiologiske procedurer, der skaber genetisk identiske celler eller organismer, der bærer DNA eller genet, der er af interesse. Kloning er en teknik, der involverer indsættelse af det interesserede gen eller DNA i en vektor, replikation af det inden i en værtsbakterie og produktion af celler eller organismer, der er nøjagtige kopier af den genetiske sammensætning. Subkloning er en teknik, der involverer indsættelse af genet af interesse, som allerede er indsat i en vektor, i en sekundær vektor, replikering af den inden i en værtsbakterie og produktion af genetisk identiske kopier af celler eller organismer. Hovedforskellen mellem kloning og subkloning er, at genet af interesse, når det først er ligeret i en vektor, ved kloning fortsætter kloningsprocessen, mens det i subkloningen erdet allerede klonede gen af interesse adskilles fra modervektoren og indsættes igen i en modtagervektor og fortsætter processen.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er kloning
3. Hvad er subkloning
4. Sammenligning side om side - Kloning vs subkloning
5. Resumé
Hvad er kloning?
Kloning er den procedure, der producerer genetisk identiske organismer eller celler. I naturen sker kloning ved hjælp af aseksuel reproduktion. Når der ikke er nogen genetisk rekombination eller ændring, modtager datterceller samme genetiske sammensætning af forældrene. Prokaryote og eukaryote organismer skaber kloner ved binær fission, spirende, mitose osv. I molekylærbiologi er kloning af gener eller specifikke fragmenter af DNA en populær metode til at studere strukturen og funktionen af det pågældende DNA-afsnit.
Hovedformålet med molekylær kloning er at lave millioner af kopier af genetisk identiske celler eller organismer, der bærer DNA-fragmentet af interesse (hovedsagelig gener). Det skaber organismer med nøjagtige genetiske kopier af en anden. Primært klones specifikke gener i molekylære studier for at opnå strukturel og funktionel information og til DNA-sekventering. Også til produktion af specifikke proteiner eller produkter i stor skala anvendes kloning i vid udstrækning.
Kloningsprocedure
De grundlæggende trin i kloningsproceduren er som følger.
- Identifikation og isolering af genet af interesse. (Amplifikation af genet af interesse ved PCR).
- Restriktionsfordøjelse af genet af interesse (Restriktionsendonuklease skær genet).
- Restriktionsfordøjelse af vektor-DNA'et. (Vektor-DNA skæres også under anvendelse af den samme restriktionsendonuklease).
- Indsættelse af genet i vektoren og dannelse af det rekombinante molekyle.
- Transformation af den rekombinante vektor til en værtsbakterie.
- Isolering og identifikation af de transformerede bakterier (plasmidvektor skal indeholde et selekterbart gen, oftest et antibiotikaresistensgen til screening af transformerede bakterier).
- Rekombinant genekspression i værten.
Figur_01: Kloningsprocedure
Hvad er underkloning?
Subkloning er en procedure til at flytte et gen af interesse fra en vektor til en anden vektor for at se ekspressionen af genet for at opnå den ønskede funktionalitet af genet. I denne metode er to vektorer involveret; nemlig overordnet vektor og destinationsvektor. Klonede indsatser flyttes igen til en anden vektor under subkloning. Formålet med at overføre genet fra den første vektor til den anden vektor er at opnå noget, som ikke kunne udføres af den første vektor eller at adskille et gen igen inden i det allerede klonede fragment af DNA og udtrykke det alene. Restriktionsenzymer anvendes i denne procedure i starten.
Procedure for underkloning
De grundlæggende trin i subkloning er som følger.
- Ved hjælp af restriktionsendonukleaser adskilles DNA af interesse i donorplasmidet (modervektor).
- Amplifikation af DNA af interesse ved hjælp af PCR.
- Oprensning af PCR-produktet (DNA af interesse) ved gelelektroforese.
- Åbning af modtagerplasmidet med samme restriktionsendonukleaser anvendt til at adskille DNA af interesse i moderplasmidet.
- Ligering af DNA af interesse (gen) i modtagerplasmidet til dannelse af det subklonede plasmid.
- Transformation af den subklonede vektor til en kompetent værtsbakterie.
- Screening af transformerede celler.
- Oprensning af plasmid-DNA'et og anvendelse til DNA-sekventering eller ekspression af generne til opnåelse af de ønskede produkter.
Subkloning udføres ved lejligheder med isolering af et gen fra den klonede gruppe af gener, eller når genet af interesse er nødvendigt at overføre til et nyttigt plasmid for at se den nøjagtige funktion af genet af interesse.
Figur_02: Fremgangsmåde til underkloning
Hvad er forskellen mellem kloning og underkloning?
Diff artikel midt foran bordet
Kloning vs subkloning |
|
| Kloning er den procedure, der producerer genetisk identiske organismer eller celler. | Subkloning er en procedure til at flytte et gen af interesse fra en vektor til en anden vektor for at se ekspressionen af genet for at opnå den ønskede funktionalitet af genet. |
| Behandle | |
| Adskil DNA'et af interesse fra organismen og indsat i en vektor en gang og klonet | Allerede klonet DNA er adskilt fra den første vektor og indsat i en anden vektor og klonet. |
| Indsæt bevægelse via vektorer | |
| Flytter ikke indsatser (DNA af interesse) fra en vektor til en anden vektor. | Flyt indsatser fra overordnet vektor til destinationsvektor. |
Resumé - kloning vs subkloning
Kloning skaber genetisk identiske celler eller organismer med det indsatte gen eller DNA af interesse. Det fortsætter gennem adskillelse og indsættelse af DNA af interesse i en vektor og ekspression i en værtsbakterie. Underkloning deler lignende trin med kloning. Ved subkloning indsættes imidlertid allerede klonet DNA-fragment (gen af interesse) i en vektor og transformeres til en værtsbakterie. Det er nøgleforskellen mellem kloning og subkloning.
