PCR vs PCR i realtid
PCR- eller polymerasekædereaktion er en revolutioneret opdagelse inden for moderne molekylærbiologi, som først blev udviklet af kemikeren Kary Mullis i 1983. Det gør det muligt at amplificere en enkelt sekvens i et komplekst DNA til analyse. Den grundlæggende idé med PCR er, at to primere, der er komplementære til de modsatte tråde af en DNA-sekvens, er orienteret mod hinanden; primerne producerer komplementære tråde, der hver indeholder den anden primer. Derfor er resultatet en stor mængde af en sekvens svarende til DNA'et, der ligger mellem de to primere. DNA-polymeraseenzym anvendes til at udvide primerne i PCR. DNA-polymerase er et termostabilt enzym, og det har evnen til at overleve ved høje temperaturer (94 til 95 ° C), der anvendes til denaturering af skabelon-DNA.
PCR involverer tre trin, nemlig gentagne runder af denaturering, annealing af primere og syntese af DNA. En termocycler-maskine bruges til at udføre denne reaktion, så den kan programmeres til at ændre temperaturerne hurtigt og præcist. Anvendelser af PCR er kriminelle efterforskninger, DNA-fingeraftryk, påvisning af patogener og analyse af DNA fra tidlige menneskelige arter.
Hvad er konventionel PCR?
Der er tre hovedfaser af konventionel PCR, nemlig; DNA-amplifikationstrin, adskillelse af PCR og påvisning af produkter. Adskillelse af DNA-segmenter udføres typisk ved agarosegelelektroforese. Produkterne farves derefter med etheiduimbromid. Endelig opnås detektion ved visualisering af bånd på geler under UV-lys. Derfor udtrykkes de endelige resultater af konventionel PCR ikke som tal. Normalt er den konventionelle PCR kun i stand til at detektere en enkelt parameter.
Hvad er PCR i realtid?
Real-time PCR kan registrere amplifikation af produkter, når produkterne syntetiseres. Med udviklingen af teknologi er PCR blevet en meget populær teknik, især til påvisning og identifikation af bakterier i fødevarer. Realtids-PCR bruger et fluorescerende farvesystem og en termocycler udstyret med fluorescerende detektionsfunktion.
Hvad er forskellen mellem konventionel PCR og realtids PCR?
• Konventionel PCR er mere tidskrævende, da den bruger gelelektroforese til at analysere de amplificerede PCR-produkter. I modsætning hertil er PCR i realtid mindre tidskrævende, da det kan detektere amplifikationer i de tidlige faser af reaktionen.
• PCR i realtid indsamler data i den eksponentielle vækstfase af PCR, mens traditionel PCR indsamler data ved slutpunktet for reaktionen.
• Slutpunktsresultaterne for konventionel PCR er muligvis ikke særlig præcise, men resultaterne af realtids-PCR er meget præcise.
• Real-time PCR er mere følsom end konventionel PCR.
• Konventionel PCR har meget dårlig opløsning, mens realtids PCR kan registrere meget små ændringer på grund af den høje opløsning.
• Slutpunktsdetektering af konventionel PCR har kort dynamisk område, mens realtids PCR-detektion har bredt dynamisk område.
• I modsætning til konventionel PCR findes automatiske detektionsteknikker i realtid PCR.
• Konventionel PCR er meget sofistikeret og arbejdskrævende mere end PCR i realtid.
• I modsætning til realtids-PCR kan konventionel PCR ikke skelne mellem døde og levende bakterier.
• Realtids-PCR bruger fluorescerende farvestofsystem til at detektere produkterne, mens konventionel PCR bruger ethidiumbromid og UV-lys til at visualisere bånd i agarosegelmediet.
