Nøgleforskel - PCR vs DNA-sekventering
PCR og DNA-sekventering er to vigtige teknikker inden for molekylærbiologi. Polymerase Chain Reaction (PCR) er den proces, der skaber et stort antal kopier af et DNA-fragment. DNA-sekventering er den teknik, der resulterer i den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i et givet DNA-fragment. Dette er nøgleforskellen mellem PCR og DNA-sekventering. PCR er et af de største trin involveret i DNA-sekventering.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er PCR
3. Hvad er DNA-sekventering
4. Sammenligning side om side - PCR vs DNA-sekventering
5. Resume
Hvad er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en DNA-amplifikationsteknik, der anvendes i molekylærbiologi. Det producerer tusinder til millioner af kopier af et bestemt DNA-fragment. Denne metode blev udviklet af Kary Mullis i 1983. I denne teknik tjener fragmentet af DNA, der skal amplificeres, som skabelon, og DNA-polymeraseenzym tilføjer komplementære nukleotider til primeren, som er tilgængelig i PCR-blandingen. Ved afslutningen af PCR-reaktionen syntetiseres mange kopier af prøve-DNA'et.
Der er forskellige komponenter i PCR-blandingen, herunder DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primere (fremad- og omvendt primere), nukleotider (byggesten af DNA) og en buffer. PCR sker inde i en PCR-maskine, og den korrekte PCR-blanding skal lægges i maskinen, og det rigtige program skal køres. Denne teknik muliggør produktion af tusinder til millioner af kopier af en bestemt del af DNA fra en meget lille mængde DNA.
PCR-reaktioner forekommer på en cyklisk måde for at producere den synlige mængde PCR-produkter på en gel. Der er tre hovedtrin involveret i en PCR-reaktion, nemlig denaturering, primerudglødning og strengforlængelse som vist i figur 01. Disse tre trin forekommer ved tre forskellige temperaturer. DNA findes i dobbeltstrenget form ved hydrogenbindinger mellem de komplementære baser. Før implikation skal dobbeltstrenget DNA adskilles fra hinanden. Det gøres ved at give en høj temperatur. Ved høj temperatur dobbeltstrenget DNA-denaturering i enkeltstrenge. Derefter skulle primerne komme tættere på de flankerende ender af det specifikke fragment eller DNA'ets gen. Primer er et kort stykke enkeltstrenget DNA, der er komplementært til målsekvensen. Primere fremad og bagud udglødes med de komplementære baser ved de flankerende ender af det denaturerede prøve-DNA ved annealingstemperaturen. Primere skal være varmebestandige. Når primere annealer med prøve-DNA, initierer taq-polymeraseenzym syntesen af de nye tråde ved tilsætning af nukleotider, som er komplementære til mål-DNA'et. Taq polymerase er et varmestabilt enzym isoleret fra en termofil bakterie kaldet Thermus aquaticus. PCR-buffer opretholder de optimale betingelser for taq-polymerase-handlingen. Disse tre faser af PCR-reaktioner gentages for at producere den krævede mængde PCR-produkt. Efter hver PCR-reaktion fordobles antallet af DNA-kopien. Derfor kan en eksponentiel amplifikation observeres i PCR. PCR-produkter kan observeres ved hjælp af gelelektroforese og kan oprenses til yderligere undersøgelser.
Figur 01: Store trin i en PCR-reaktion
PCR er et værdifuldt værktøj inden for medicinsk og biologisk forskning. PCR har en særlig værdi inden for retsvidenskab, da den kan forstærke DNA til studier fra de små prøver fra de kriminelle og lave retsmedicinske DNA-profiler. PCR anvendes i vid udstrækning i mange områder af molekylærbiologi, herunder genotypebestemmelse, genkloning, mutationsdetektion, DNA-sekventering, DNA-mikroarrays og faderskabstest osv.
Figur 02: Polymerase-kædereaktion
Hvad er DNA-sekventering?
DNA-sekventering er bestemmelsen af en nøjagtig rækkefølge af nukleotiderne - adenin, guanin, cytosin og thymin i et givet DNA-fragment. Genetisk information lagres i DNA-sekvenserne ved hjælp af den rigtige rækkefølge af nukleotiderne. Derfor er det meget vigtigt at finde den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i et DNA-fragment at vide om genenes struktur og funktion.
DNA-sekventeringsprotokol involverer forskellige processer. Det første trin er isolering af interesseret DNA eller genomisk DNA fra en organisme. Ved hjælp af PCR (som beskrevet ovenfor) skal den ønskede region af DNA amplificeres. Amplificeret PCR-produkt skal adskilles ved gelelektroforese og renses. Amplificerede fragmenter serveres som skabeloner til sekventering. Sekventering kan udføres enten efter Sanger-sekventering eller sekvenseringsmetode med høj kapacitet. Sanger-sekventering kræver kapillær elektroforese af resulterende DNA-fragmenter. Bestemmelse af den korrekte nukleotidrækkefølge kan udføres ved manuel aflæsning af autoradiografier eller ved anvendelse af automatiserede DNA-sekventeringsmidler.
Gensekventering bidrog til Human genom-projektet og letter kortlægningen af det humane genom i 2003. I retsmedicin muliggjorde DNA-sekventering identifikation af individer, der viser unikke DNA-sekvenser og identificerer de kriminelle. Inden for medicin kan DNA-sekventering bruges til at detektere de gener, der er ansvarlige for genetiske og andre sygdomme, finde defektgener og erstatte dem med korrekte gener. I landbruget anvendes DNA-sekventeringsoplysninger for nogle mikroorganismer til at producere transgene afgrøder med økonomisk ønskede egenskaber.
Figur 03: DNA-sekventering
Hvad er forskellen mellem PCR og DNA-sekventering?
Diff artikel midt foran bordet
PCR vs DNA-sekventering |
|
| PCR-processen skaber tusinder til millioner af kopier af det interesserede DNA-fragment. | DNA-sekventering er processen til bestemmelse af den nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i et givet DNA-fragment. |
| Resultat | |
| PCR skaber tusinder til millioner af kopier af et bestemt DNA-fragment | Dette resulterer i den korrekte rækkefølge af baserne i et bestemt DNA-fragment. |
| Involvering af ddNTP'er | |
| PCR kræver ikke ddNTP'er. Det bruger dNTP'er. | DNA-sekventering kræver ddNTP'er for at afslutte dannelse af streng. |
Resumé - PCR vs DNA-sekventering
PCR og DNA-sekventering er meget vigtige værktøjer i mange områder af molekylærbiologi. Amplifikation af DNA-fragmenterne udføres ved hjælp af PCR-teknikken, medens den korrekte rækkefølge af nukleotiderne i et DNA-fragment bestemmes af DNA-sekventeringen. Dette er forskellen mellem PCR og DNA-sekventering.
