Nøgleforskel - PCR-primere vs sekventeringsgrunder
Med den nylige udvikling inden for molekylærbiologi blev der udviklet forskellige genetiske teknikker, der gjorde undersøgelsesprocesserne i forskellige veje af emnet lette og præcise. PCR og andre sekventeringsprocedurer er to vigtige sådanne teknikker. De bruger forskellige underkomponenter. Primere betragtes som den vigtigste underkomponent, der er fælles for både PCR og sekventeringsteknikker. PCR-primere anvendes til amplifikation af en bestemt DNA-sekvens, medens sekventeringsprimere anvendes i sammenhæng med sekvensering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke rækkefølge af nukleotidsekvensen. Dette er nøgleforskellen mellem PCR-primere og sekventeringsprimere.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er PCR-primere
3. Hvad er sekventeringsprimere
4. Ligheder mellem PCR-primere og sekventeringsprimere
5. Sammenligning side om side - PCR-primere vs sekventeringsprimere i tabelform
6. Resumé
Hvad er PCR-primere?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en genetisk teknik, der anvendes inden for molekylærbiologi for at forstærke en enkelt eller få kopier af et bestemt DNA-segment og for at opnå mange millioner identiske kopier. I en PCR-reaktion anvendes forskellige komponenter inklusive primere. Primere er korte DNA-tråde med en nukleotidlængde på 18-25, hvilket gør dem kompatible med start- og slutområdet af de DNA-fragmenter, der skal amplificeres. Primere kan være en fremadgående primer og omvendt primer. Disse primere binder til DNA-fragmentet ved de specifikke punkter, hvor det fremstiller DNA-polymerase til at binde til den specifikke primer på stedet og initiere syntesen af den nye DNA-streng.
Valget af primere er et vigtigt aspekt af PCR-processen. Valget af længden af primeren er vigtig. Den ideelle længde ville være 18-25 nukleotider. Hvis længden er for kort eller for lang, binder primerne ikke til DNA-sekvensen, der skal amplificeres nøjagtigt. Primere, der er for korte i længden, fører til ikke-specifik primerudglødning på forskellige steder i DNA-sekvensen.
Figur 01: PCR-primere
Guanin- og cytosinindholdet (GC) i en god primer skal være i området 40-60. Primerudglødningstemperaturen og smeltetemperaturen er vitale faktorer under PCR. Smeltetemperaturen skal beregnes nøjagtigt, og primerudglødningstemperaturen skal være 5 0 C lavere end smeltetemperaturen. Smeltetemperaturen skal være 60 ° C og 75 ° C. For høje eller for lave temperaturer vil resultere i mindre aktiv DNA-polymeraseaktivitet.
Hvad er Sequencing Primers?
Sekventeringsprimere anvendes i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. For at opnå gode sekvenseringsresultater er primere og skabeloner af høj kvalitet vigtige. Når primere vælges, skal de således være unikke for et bestemt område, hvor vi ønsker at sekvensere. Det skal også være med en korrekt retning, hvor sekvenserne normalt genereres fra 3 'til 5' ender af primerne. Sekvensen bør mangle uønsket selvhybridisering, såsom dannelse af hårnålssløjfer. Det bør ikke indeholde sammenhængende dannelse af Guanine-baser.
Primerens smeltetemperatur (Tm) skal være egnet til betingelserne for sekventeringen. Derfor bør den ligge mellem 52 ° C og 74 ° C. Fremstilling af oligonukleotider, der skal anvendes som en primer, bør oprenses for at opnå den ønskede fulde længde af sekvensen. Hvis oligonukleotiderne indeholder urenheder, vil primersekvenssignaliseringen blive overlejret fra forskellige primingsites, og det vil også reducere antallet af baseceller.
Figur 02: Sekventeringsgrunder
Primersmeltetemperaturen (Tm) for et oligonukleotid bestemmer, hvor stærke de komplementære DNA-tråde hybridiseres med hinanden. Tm kan betragtes som en termodynamisk beregning, hvor den er afhængig af både DNA-sekvenser og adskillige betingelser, såsom saltkoncentration. Tm er vigtig under PCR, hvor en variant kaldet cyklus-sekventering anvendes til at producere en gruppe dideoxynukleotid-terminerede fragmenter. Her vil primeren, der er sekventeret, oprindeligt annealeres alternativt, derefter forlænges og sidst denatureres til amplifikation. Derfor bør Tm-værdien være mellem 52 o C og 74 oC. Syntetiserede oligonukleotider kan opnås fra DNA / RNA-synteselaboratorier efter valg. Den lille synteseskala, der bruges til DNA-sekventering, er normalt 50 nmol. Også vigtigst af alt skal de primere, der anvendes til sekventering, renses for at være fri for urenheder, der forhindrer kvalitetsreduktion.
Hvad er ligheden mellem PCR-primere og sekventeringsprimere?
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er primere, der anvendes i amplifikationsprocessen af en målrettet DNA-sekvens.
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er sammensat af nukleotider.
- Både PCR-primere og sekventeringsprimere er korte oligomerer.
Hvad er forskellen mellem PCR-primere og sekventeringsprimere?
Diff artikel midt foran bordet
PCR Primers vs Sequencing Primers |
|
| PCR-primere er korte DNA-tråde med en nukleotidsekvenslængde på 18-25, hvilket gør dem kompatible med start- og slutområdet af de DNA-fragmenter, der skal amplificeres. | Sekventeringsprimere er korte oligomerer, der anvendes i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. |
| Fungere | |
| PCR-primere anvendes til amplifikation af en bestemt DNA-sekvens. | Sekventeringsprimere anvendes i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. |
| Antal nødvendige primere | |
| To primere; en fremadgående primer og en omvendt primer anvendes som PCR-primere. | Brug kun en primer som sekventeringsprimer. |
Resumé - PCR Primers vs Sequencing Primers
Sekventeringsprimere anvendes i sammenhæng med sekventering af et DNA-fragment med det formål at afsløre dets specifikke identitet. En sekventeringsprimer vil være nok til at køre processen. For at opnå gode sekventeringsresultater er primere og skabeloner af høj kvalitet vigtige. Når primere vælges, skal de således være unikke for et bestemt område, hvor vi ønsker at sekvensere. PCR-primere er korte DNA-tråde med en nukleotidlængde på 18-25, som er kompatibel med start- og slutområdet af de DNA-fragmenter, der skal amplificeres. PCR-primere kan være en fremadgående primer og omvendt primer. Guanin- og cytosinindholdet (GC) i en god primer skal være i området 40-60. Primerudglødningstemperaturen og smeltetemperaturen er vitale aspekter under PCR. Dette er forskellen mellem PCR-primere og sekventeringsprimere.
