Nøgleforskel - SYBR Green vs Taqman
SYBR Green og Taqman er to metoder, der anvendes til at detektere eller se amplifikationsprocessen af realtids-PCR. SYBR Green er en metode baseret på interkalering af nukleinsyrefarvningsfarvestof, mens Taqman er en metode baseret på hydrolysesonde. Begge teknologier er designet til at generere fluorescens under PCR, hvilket giver realtids PCR-maskine mulighed for at overvåge reaktionen i "realtid". SYBR Green-metoden udføres ved hjælp af et fluorescerende farvestof kaldet SYBR green og detekterer amplifikationen ved at binde farvestoffet til produceret dobbeltstrenget DNA. Taqman udføres ved hjælp af dobbeltmærkede prober og detekterer amplifikationen ved nedbrydning af proben ved Taq-polymerase og frigivelser af fluoroforen. Dette er nøgleforskellen mellem SYBR Green og Taqman.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er SYBR Green
3. Hvad er Taqman
4. Sammenligning side om side - SYBR Green vs Taqman
5. Resume
Hvad er SYBR Green?
SYBR Green er et fluorescerende farvestof, der bruges til at plette nukleinsyrer, især dobbeltstrenget DNA i molekylærbiologi. SYBR Green-metoden bruges til at kvantificere PCR-produkter under realtids-PCR. Når det først er bundet med DNA, absorberer det resulterende DNA-farvestofkompleks blåt lys og udsender intens grønt lys. Det sker på grund af den strukturelle ændring, der opstår i farvestofmolekylet ved binding med dobbeltstrenget DNA. Når PCR skaber mere og mere DNA, binder flere farvestofmolekyler med DNA, hvilket genererer mere fluorescens. Derfor øges fluorescensen med akkumuleringen af PCR-produktet. Derfor kan mængden af PCR-produkt kvantitativt måles ved SYBR Green-fluorescensdetektion.
SYBR-grønt farvestof kan også bruges til DNA-mærkning i cytometri og fluorescerende mikroskopi. Ethidiumbromid er med succes blevet erstattet af SYBR Green, da Ethidiumbromid er et kræftfremkaldende farvestof med bortskaffelsesproblemer under DNA-visualisering i gelelektroforesen.
Der er fordele og ulemper ved SYBR grøn metode. Denne metode er meget følsom, billig og nem at bruge. På grund af dets evne til at binde til et hvilket som helst dobbeltstrenget DNA kan ikke-specifik binding imidlertid føre til overdreven kvantificering af PCR-produkt.
Figur 01: SYBR grøn teknik
Hvad er Taqman?
Taqman er en alternativ metode til SYBR Green til at overvåge realtids PCR-proces. Denne metode afhænger af 5 '- 3' exonuclease-aktiviteten af Taq-polymeraseenzym for at nedbryde proberne under forlængelse af den nye streng og frigivelse af fluorofor. Dobbeltmærkede prober anvendes i denne metode, og den er baseret på hydrolyse af prober. Prober er fluorescerende mærkede DNA-oligonukleotider med et fluorescerende reportermolekyle (fluorofor) i 5'-enden og et quencher-molekyle i 3'-enden. De er designet til at binde til den enkeltstrengede skabelon på den modsatte side af primerglødningerne. Taq-polymerase tilføjer nukleotider til primeren og udvider den nye streng mod de dobbeltmærkede prober. Når Taq-polymerasen møder sonden, aktiveres og nedbrydes sags eksonukleaseaktion af Taq-polymerasen. Når den først har afsluttet syntesen af den nye streng, udsættes proben for fuldstændig nedbrydning og frigiver fluoroforen. Frigivelsen af fluorofor genererer fluorescens. Fluorescerende quencher-molekyle slukker effektivt det udsendte lys og skaber output til kvantificering af PCR-produktet. Frigivelsen af fluoroforer og mængden af PCR-produkterne er proportional. Derfor kan kvantificering let udføres ved hjælp af Taqman-metoden.kvantificering kan let udføres ved hjælp af Taqman-metoden.kvantificering kan let udføres ved hjælp af Taqman-metoden.
Figur 02: Taqman-metoden
Taqman-metoden anvendes i realtid PCR, kvantificering af genekspression, påvisning af genetiske polymorfier, kvantificering af kromosomale DNA-sletninger, bakteriel identifikation, verifikation af mikroarrayanalyse, SNP-genotypebestemmelse osv.
Hvad er forskellen mellem SYBR green og Taqman?
Diff artikel midt foran bordet
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green er baseret på DNA-bindende farvestof. | Taqman afhænger af hybridiseringsprober og 5 'til 3' exonukleaseaktivitet af Taq-polymerase. |
| Fluorescensmærkede prober | |
| Ingen fluorescerende mærkede sonder er ikke påkrævet. | Dobbeltmærkede sonder er påkrævet. |
| Multiplex genanalyse | |
| Det kan ikke bruges til multiplex-genmål. | Det kan bruges til multiplex-genmål. |
| Koste | |
| Dette er billigere. | Dette er dyrere. |
| Specificitet | |
| Dette er mindre specifikt og binder med ethvert dobbeltstrenget DNA | Disse er meget specifikke, da prober detekterer de specifikke amplifikationsprodukter. |
| Effektivitet | |
| Dette er mindre effektivt. | Dette er yderst effektivt. |
| Ansøgning | |
| Dette bruges i realtid PCR, agarosegel visualisering, DNA mærkning osv. | Dette bruges i realtid PCR, kvantificering af genekspression, påvisning af genetiske polymorfier osv. |
Resumé - SYBR Green og Taqman
Taqman og SYBR green er to metoder, der anvendes i realtid PCR (kvantitativ PCR). Begge metoder muliggør kvantificering af PCR-produktet effektivt og er afhængige af emission af fluorescens. Taqman-metoden bruger dobbeltmærkede sonder til påvisning af det akkumulerede DNA, mens SYBR Green-metoden bruger et fluorescerende farvestof. Begge disse metoder har også forskellige anvendelser inden for molekylærbiologi.
