Forskellen Mellem Nordlig Sydlig Og Vestlig Blotting

2024 Forfatter: Mildred Bawerman | [email protected]. Sidst ændret: 2023-12-16 08:37

Nøgleforskel - Nordlig vs Sydlig vs Western Blotting

Påvisning af specifikke sekvenser af DNA, RNA og proteiner er afgørende for forskellige typer undersøgelser inden for molekylærbiologi. Gelelektroforese er en teknik, der adskiller DNA, RNA og proteiner efter deres størrelse. Fra gelprofilerne detekteres særlig DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein ved hjælp af de specielle teknikker kaldet blotting og hybridisering med mærkede prober. Der er tre forskellige typer blotting-metoder, nemlig sydlige, nordlige og vestlige. Hovedforskellen mellem nordlig sydlig og vestlig blotting ligger med typen af molekylet, den opdager fra en prøve. Southern blotting er en metode, der detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Northern blotting er en teknik, der detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve. Western blotting er en metode, der detekterer et specifikt protein fra en proteinprøve.

INDHOLD

1. Oversigt og nøgleforskel

2. Hvad er Southern Blotting

3. Hvad er Northern Blotting

4. Hvad er Western Blotting

5. Sammenligning side om side - Northern vs Southern vs Western Blotting

6. Resumé

Hvad er Southern Blotting?

Southern blotting-teknik blev udviklet af EM Southern i 1975 til identifikation af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Dette er den første blotting-teknik introduceret i molekylærbiologi. Det muliggjorde påvisning af specifikke gener fra DNA'et, specifikke fragmenter fra DNA osv. Der er flere trin involveret i Southern blotting-teknik. De er som følger.

1. DNA isoleres fra prøven og fordøjes med restriktionsendonukleaser.
2. Fordøjet prøve adskilles ved hjælp af Agarosegelelektroforese.
3. DNA-fragmenter i gelen denatureres i enkelte tråde ved anvendelse af en alkalisk opløsning.
4. Enkeltstrenget DNA overføres til en nitrocellulosefiltermembran ved kapillæroverførsel.
5. Overført DNA er permanent fastgjort på membranen.
6. Fast DNA på membranen hybridiseres med mærkede prober.
7. Ubundet DNA vaskes af membranen ved vask.
8. Røntgenfilm udsættes for membranen, og der udarbejdes en autoradiograf.

Southern blotting anvendes til forskellige aspekter af molekylærbiologi. Det er nyttigt i RFLP-kortlægning, retsmedicinske undersøgelser, DNA-methylering i genekspression, påvisning af muterede gener i genetiske lidelser, DNA-fingeraftryk osv.

Figur 01: Southern Blotting-teknik

Hvad er Northern Blotting?

Northern blotting er en metode designet til at detektere en specifik RNA-sekvens eller mRNA-sekvens fra en prøve for at undersøge genekspression. Denne teknik blev udviklet af Alwine, Kemp og Stark i 1979. Den adskiller sig fra sourthern og western blotting-teknikker på grund af flere trin. Imidlertid udføres denne teknik også via gelelektroforese, blotting og hybridisering med specifikke mærkede sonder og påvisning. Northern blotting-teknik udføres som følger.

1. RNA ekstraheres fra prøven og separeres ved gelelektroforese.
2. RNA overføres fra gelen til en blottingmembran og fikseres.
3. Membranen behandles med en mærket probe fremstillet af cDNA eller RNA (sonden er komplementær til en specifik sekvens i prøven).
4. Sonden inkuberes med membranen for at binde til en specifik sekvens.
5. Ubundne sonder vaskes af.
6. Hybridiserede fragmenter påvises ved hjælp af en autoradiograf.

Northern blotting er et vigtigt redskab til påvisning og kvantificering af hybridiseret mRNA, undersøgelse af RNA-nedbrydning, evaluering af RNA-halveringstid, påvisning af RNA-splejsning, undersøgelse af genekspression osv.

Figur 02: Northern Blotting

Hvad er Western Blotting?

Western blotting er en metode til påvisning af et specifikt protein fra en proteinblanding ved anvendelse af mærket antistof. Derfor er western blot også kendt som en immunoblot. Denne teknik blev introduceret af Towbin et al i 1979, og den udføres nu rutinemæssigt i laboratorierne til proteinanalyse. Trinene er som følger.

1. Proteiner ekstraheres fra prøven
2. Proteiner adskilles efter deres størrelse ved anvendelse af polyacrylamidgelelektroforese
3. Separerede molekyler overføres til en PVDF-membran eller nitrocellulosemembran ved elektroporation
4. Membranen er blokeret for ikke-specifik binding med antistofferne
5. Overførte proteiner er bundet til primært antistof (enzymmærket antistoffer).
6. Membranen vaskes for at fjerne ikke-specifikt bundne primære antistoffer
7. Bundne antistoffer påvises ved tilsætning af et substrat og påvisning af dannet farvet bundfald

Western blotting er nyttigt til påvisning af anti-HIV-antistoffer i en human serumprøve. Western blot kan også bruges som en bekræftende test for hepatitis B-infektion og endelig test for gale ko-sygdomme.

Figur 03: Western Blotting

Hvad er forskellen mellem Northern Southern og Western Blotting?

Diff artikel midt foran bordet

Northern vs Southern vs Western Blotting
Type detekteret molekyle
Northern Blotting	Northern blotting detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve.
Southern Blotting	Southern blotting detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve.
Western blotting	Western blotting registrerer et specifikt protein fra en proteinprøve.
Type gel
Northern Blotting	Dette bruger Agarose / formaldehydgel.
Southern Blotting	Dette bruger en Agarose gel.
Western blotting	Dette bruger polyacrylamidgel.
Blotting-metode
Northern Blotting	Dette er en kapillær overførsel.
Southern Blotting	Dette er en kapillær overførsel.
Western blotting	Dette er en elektrisk overførsel.
Sonder brugt
Northern Blotting	cDNA- eller RNA-prober mærket radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Southern Blotting	DNA-prober er mærket radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Western blotting	Primære antistoffer anvendes som prober.
Registreringssystem
Northern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiograf eller påvisning af lys eller farveændring.
Southern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiografi, detektion af lys eller farveændring.
Western blotting	Dette gøres ved hjælp af påvisning af lys eller farveændring.

Resumé - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting er en speciel teknik udviklet til identifikation af specifikt DNA, RNA eller protein fra prøverne. Der er tre separate blottingprocedurer, nemlig nordlige, sydlige og vestlige, til at detektere en bestemt type molekyle. Northern blotting-teknik er designet til at detektere en specifik RNA-sekvens fra en blanding af RNA. Southern blotting-teknik muliggør påvisning af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve, og western blotting-teknik er udviklet til at identificere et specifikt protein fra en proteinblanding.