Nøgleforskel - Varm vs kold trypsinisering
Varm og kold trypsinisering er to metoder, der anvendes til enzymatisk opdeling af celler i dyrecelledyrkning. Hovedforskellen mellem varm og kold trypsinisering, som navnene antyder, afhænger af temperaturen, hvormed trypsin tilsættes til cellulær opdeling. Varm trypsinisering finder sted under højere temperaturforhold (36,5 - 37 0 C), mens kold trypsinisering finder sted under lave temperaturforhold.
Under processen med primær cellekultur af dyreceller er der tre hovedmetoder, der anvendes og har vist sig at være en succes. De tre metoder inkluderer mekanisk opdeling af celler, enzymatisk opdeling af celler og den primære eksplantatteknik. Den enzymatiske opdeling af celler, der fører til isolering af celler, og det udføres af det protein-nedbrydende enzym trypsin. Derfor er denne proces kendt som trypsinisering. Trypsinisering kan udføres under to forskellige betingelser, nemlig varm trypsinisering og kold trypsinisering. Varm trypsinisering er metoden til behandling af cellerne med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 - 37 0C. Kold trypsinisering er processen med trypsinbehandling, der finder sted under koldere forhold, fortrinsvis i is, der opretholder meget lave temperaturer.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er varm trypsinisering
3. Hvad er kold trypsinisering
4. Ligheder mellem varm og kold trypsinisering
5. Sammenligning side om side - Varm vs kold trypsinisering i tabelform
6. Resumé
Hvad er varm trypsinisering?
Trypsinisering kan udføres for at opdele de cellulære komponenter for at isolere cellerne for at producere en primær cellekultur. Trypsin er et proteinnedbrydningsenzym, og den enzymblanding, der anvendes ved trypsinisering, kan enten være et råekstrakt eller et oprenset produkt. Råekstrakten siges at være mere effektiv i proteinlysering og celledisintegration, da den indeholder andre nedbrydende enzymer.
Varm trypsinisering er den mest anvendte enzymatiske metode til celleopdeling, der finder sted under højere temperaturforhold. Før behandlingen ved trypsinisering hakkes det ønskede væv i mindre stykker. Det letter den nemme opdelingsproces. Det hakkede væv vaskes derefter i et specielt medium kendt som Dissection Basal Salt-mediet.
Efter afslutningen af vasketrinet omdannes cellerne til en kolbe indeholdende det aktive enzym, som er trypsin. Da denne teknik indebærer en varm trypsinisering protokol er trypsin anbringes ved en temperatur på omkring 37 0 C i ca. fire timer.
Figur 01: Trypsin
Indholdet blandes og omrøres ved hjælp af centrifugeringsmetoder for at gøre det nemmere for protokollen og for at fremskynde opdelingsprocessen. Når den anbefalede tid er opnået, kan cellerne afledes fra supernatanten. Cellerne afledt af supernatanten inkuberes derefter ved en bestemt temperatur og tid.
Hvad er kold trypsinisering?
Kold trypsinisering er den anden type trypsinisering, der finder sted under kolde forhold. I denne teknik placeres cellerne, der er hakket og vasket, i hætteglas på is og derefter gennemblødt med trypsin. Blødgøringsperioden er meget længere - ca. 6 - 24 timer.
Efter afslutning af iblødsætning procedure den trypsin fjernes fra cellelysatet, og vævsstykkerne inkuberes yderligere ved 37 0 C i ca. 20 - 30 minutter. Opdelingen af cellerne tilvejebringes ved gentagen pipettering af vævsblandingen. Dette gør det muligt for cellerne at adskille sig fra membranen og komme til supernatanten. Når cellerne først er i supernatanten, inkuberes de og dyrkes ved en ønsket temperatur og tidsperiode.
Den kolde trypsiniseringsmetode har flere fordele
- Højere udbytte af levedygtige celler, da celleskader minimeres. Cellebeskadigelsen minimeres ved ikke at bruge centrifugeringstrin.
- Meget praktisk metode.
- Mindre besværlig.
Hovedbegrænsningen ved den kolde trypsiniseringsmetode er, at store mængder ikke kan bruges i et tilfælde.
Hvad er ligheden mellem varm og kold trypsinisering?
- Både varme og kolde trypsiniseringsprocesser bruger enzymet trypsin til opdeling af celler.
- Både varme og kolde trypsiniseringsprocesser anvendes i cellekulturprocedurer til opdeling af celler.
- I både varme og kolde trypsiniseringsbehandlingsprocedurer stammer cellerne fra supernatanten.
Hvad er forskellen mellem varm og kold trypsinisering?
Diff artikel midt foran bordet
Varm vs kold trypsinisering |
|
| Varm trypsinisering er metoden til behandling af cellerne med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 - 37 0. | Kold trypsinisering er den proces til trypsinbehandling, der finder sted under koldere forhold, fortrinsvis i is, der opretholder meget lave temperaturer. |
| Protokol | |
| De hakkede vævsstykker holdes ved 37 0 C kontinuerligt under hele proceduren. | De hakkede vævsstykker holdes oprindeligt ved iskold temperatur og holdes derefter på 37 0. |
| Temperatur | |
| Varm trypsinisering finder sted ved 36,5 - 37 0 | Kold trypsinisering forekommer ved iskold temperatur. |
| Forbruget tid | |
| Mindre tid, der kræves for hele processen (ca. 4 timer) med varm trypsinisering. | Længere tid (ca. 6 - 24 timer) til kold trypsinisering kræves. |
| Udbytte af levedygtige celler | |
| Lav varm trypsinisering. | Høj i kold trypsinisering. |
| Brug af centrifugering | |
| Der kræves centrifugering til disaggregering af celler i varm trypsinisering. | Centrifugering er ikke påkrævet ved kold trypsinisering. |
| Indledende vævsmængde til trypsinisering | |
| En større mængde væv kan bruges til varm trypsinisering. | En mindre mængde væv kan bruges til kold trypsinisering. |
| Celleskader | |
| Høj på grund af centrifugering i varm trypsinisering. | Mindre på grund af kold trypsinisering. |
Resumé - Varm vs kold trypsinisering
Trypsinisering er metoden til anvendelse af det proteinnedbrydende enzym trypsin til opdeling og fremstilling af primære cellekulturer under celledyrkningsprocessen. Der er to hovedteknikker til trypsinisering baseret på de temperaturer, der anvendes under proceduren. De er varme og kolde trypsinisering. Varm trypsinisering udføres ved 37 0 C henviser kold trypsinisering udføres under is-kolde forhold. Selvom kold trypsinisering tager længere tid at færdiggøre, siges det at have et højere udbytte af levedygtige celler. Dette skyldes det faktum, at celleskader minimeres i kold trypsinisering, da den ikke bruger kraftige centrifugeringstrin. Dette er forskellen mellem varm og kold trypsinisering.
